生物反应器，开创脂肪间充质干细胞大规模生产时代

导读

间充质干细胞（MSC）作为细胞治疗和促进组织修复有希望的候选细胞，正广泛地应用在越来越多的临床试验中。尤其是脂肪组织来源的间充质干细胞（AT MSC），与骨髓来源相比，易于获得（每克组织约1×105个细胞），分离过程简单，被认为是分离MSC有价值的来源；在细胞治疗方面也有理想的特性，可沿经典间充质谱系分化，包括神经元细胞、心肌细胞、肝细胞、胰腺细胞，表明不同胚层的多向可塑性。此外，还有研究表明AT MSC具有优越的血管生成能力，并支持造血。

临床注射所需的细胞剂量（106个细胞/kg）要求在无动物源成分培养条件下可扩展且高效地生产AT MSC。传统的MSC培养都是采用标准的2D培养模式进行贴壁传代扩增培养的，这种方式虽然成本低且易于处理，但极易受到污染、培养出的干细胞也容易发生分化，产量受到限制，尽管多层细胞工厂表面积增加，但仍保留了静态平面培养的固有局限性。因此，建立符合GMP的大规模培养平台对于寻找标准2D静态培养系统的替代品至关重要。

近日，Francisco Moreira等人使用人AB血清补充培养基，在无动物源成分条件下，建立基于微载体的搅拌式生物反应器高效扩增AT MSC的方法，以获得足够的细胞数量，并维持细胞免疫表型和分化特性。搅拌式生物反应器可以更好地控制各种培养参数（如pH、温度和溶氧等）并减少劳动力。作者及其团队在已有研究基础上，改善培养条件，最大限度地提高生物反应器培养系统中的AT MSC产量。

材料与方法

伦理审查同意后，分别抽吸3名女性（30~40岁）脂肪组织样本各500mL，PBS清洗并均质，静置后取脂肪组织上清液相。然后将样本与0.1%的II型胶原酶37℃温育30min，再与氯化铵钾溶液温育10min以溶解红细胞，过滤离心弃上清，用α-MEM培养基重悬沉淀，并添加10%（v/v）人AB血清和1%（v/v）抗生素。计数，将细胞以5,000~10,000个/cm2的初始密度接种在培养瓶中，扩增4~5代，再将细胞冷冻保存在液氮罐中。

解冻后，将细胞以3000个/cm2密度接种在培养瓶中，添加含10%人AB血清的α-MEM培养基。达到80~90%汇合后，用TrypLETM1×消化细胞，并以相同的细胞密度传代至第3或第4代（P3/P4）。5%CO237℃温湿环境培养，每3~4天换液一次。台盼蓝法测定细胞数量和活力。

对于AT MSC的动态培养，500ml迷你生物反应器配有三叶斜桨，设置培养参数：pH 7.3，顶部通气（N2、O2和空气），20%溶氧，37℃。微载体与含10%人AB血清的α-MEM培养基孵育过夜进行包被。向生物反应器中添加20 g/L已包被的微载体，并接种12.5×106个细胞，使最终体积为150 mL。培养第3天，向生物反应器中添加100 mL新鲜培养基，并从此开始每天更换25%（v/v）的培养基。第2天之前搅拌速度设定为85 rpm，第5天之前搅拌速度设定为95 rpm，之后搅拌速度设定为105 rpm。根据斯托克斯定律，搅拌速度的增加是经验参数，以抵消由于细胞粘附逐渐增加而导致的微载体沉降速率的增加。每天收集2ml样本，进行细胞计数和代谢物分析。细胞粘附率计算为培养24小时后（相当于第0天）成功粘附到微载体上的细胞百分比。

实验结果基于微载体培养脂肪组织来源的间充质干细胞AT MSC方法的建立

作者及其团队先前的研究表明，使用商业化无血清/无动物源成分培养基进行搅拌培养时，AT MSC与微载体的粘附率较低。为此，测试了不同的包被策略（数据未显示）。MSC在人纤维连接蛋白、α-MEM+10% AB HS和α-MEM+20% AB HS包被的微载体上培养，细胞粘附率依次为37%，33%，和32%，细胞最大密度为2.2×105个/mL（第7天）2.7×105（第6天）和2.3×105（第6天）。虽然使用纤维连接蛋白包被的培养似乎呈现略高的粘附率，但其细胞密度较低并呈现较高的滞后期。因此，选择含10%体积的AB HS包被微载体进行下一步实验。

搅拌式生物反应器进行AT MSC无动物源成分的扩增培养

在500ml生物反应器中培养AT MSC，并自动控制DO、pH、搅拌速度和温度。使用相同的包被方法和细胞初始密度，生物反应器中的粘附率22±5%，第7天细胞密度2.7±0.4×105个/mL，增加了27±8倍。

在整个培养过程中，每天测量葡萄糖和乳酸浓度。第8天葡萄糖基本完全耗尽，代谢产物曲线与相应各段生长曲线相关。葡萄糖在第7天达0.35mM，此后，在每次更换培养基前都是几乎耗尽。在第7天乳酸最高浓度达到3.8mM。

培养后，获取细胞，并对其免疫表型和体外成骨、成软骨和成脂肪细胞系的分化能力进行鉴定。结果显示，AT MSC中CD54、CD73、CD90、CD105等多种标志物均呈阳性。图A显示在生物反应器中扩增后，AT MSC维持免疫表型。细胞扩增前后无显著性差异。此外，经扩增的AT MSC显示其具有多向分化潜能（图B-D）。二号苏丹红染色的脂滴形成证明分化为脂肪细胞（图B）；阿尔新蓝染色后证实了软骨形成潜能，从而证明了蛋白多糖的存在（图C）；通过用冯库萨染色的草酸钙晶体的累积来观察成骨分化能力（图D）。流式细胞术免疫表型分析的原始数据和代谢物结果见补充材料（未展示，见原文补充表S1）。

结论与讨论

在500 mL迷你生物反应器（ApplikonTMBiotechnology）中扩展培养AT MSC，细胞初始粘附率为22±5%，在第7天细胞达到最大密度2.7±0.4×105，获得27±8倍的增长。重要的是，细胞保留其免疫表型和多向分化潜能（成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞）。这种基于微载体系统的可扩展性对于实现具有临床意义的细胞数量是非常重要的。

另外，作者及其团队认为，改善细胞粘附将进一步增加细胞最大密度。不仅细胞/微载体比是影响细胞粘附的一个重要变量，而且微载体密度也起着重要作用，因为它可以促进更多的细胞与微载体接触，从而提高粘附率。确定微载体初始浓度后，细胞初始接种密度可能是提高细胞扩增的下一步。此外，微载体培养的优点是，在特定时间点直接向培养物中添加新鲜微载体，即可克服表面积的限制；

另一个关键是优化补料方案，采用上述补料方案时，乳酸没有达到hMSC培养中公认的细胞生长抑制水平（3.8 mM，报道35.4 mM为抑制），但葡萄糖在第7天后几乎耗尽。这种营养限制可以解释观察到的生长停滞期。因此，为了进一步最大限度地扩增细胞，可以将培养基更换增加到50%，更换频率增加到12小时，甚至改变灌注设置等。

该mini生物反应器是目前国内市场上工作体积最小（50mL）的搅拌式生物反应器。一对一控制，真正实现实验室规模反应器（1~15L）的缩小培养，且具有相同的灵活性、适应性。平行控制培养，每个反应器独立监控，培养基消耗少，节约成本，适用于筛选研究， 培养基、过程工艺等优化。可提供定制化服务，批次培养、流加培养、灌流培养和连续培养等，以满足客户的任何需求。能够在更短的时间获取更多数据，数据结果可扩展，5联罐所占面积不到1m2，占地空间小。

详细的研究内容，请查看原文：Moreira F, Mizukami A, de Souza LEB, Cabral JMS, da Silva CL, Covas DT and Swiech K (2020). Successful Use of Human AB Serum to Support the Expansion of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem/Stromal Cell in a Microcarrier-Based Platform. Front. Bioeng. Biotechnol. 8:307. doi: 10.3389/fbioe.2020.00307

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