芯周刊·第33期 | IF 38+汤富酬团队发布单细胞全长三代测序技术新进展

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汤富酬团队发布单细胞全长三代测序技术新进展

自2016年单细胞技术发展迅速，出现了大量不同原理和分离方案的单细胞技术平台，但这些平台大多数基于NGS测序，将RNA打断成小片段进行检测，这样提高了检测的通量和效率，但丢失了来自RNA层面的结构信息，尤其是其检测的标记端几百bp碱基，无法获得RNA全长信息导致的RNA剪接信息丢失。为了克服上面的问题，研究人员开发了SCAN-seq2，一种基于TGS平台的高通量，高灵敏度的全长RNA-seq方法。

研究对来自九个细胞系的总共5472个细胞进行了SCAN-seq2，参考引导的转录组组装，研究人员鉴定了数千种新型全长RNA亚型。并且可以准确确定高度多态性T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）基因（免疫球蛋白）的V（D）J重排事件。文章中通过SCAN-seq2和基于NGS的方法鉴定的同一文库的ERCC UMI，比较了重复性，灵敏性，稳定性等指标，均显示该方法具有优秀的性能。SCAN-seq2所需的测序深度可能远低于短读长测序。

作为一种更方便的工具，SCAN-seq2可用于以单细胞和单个RNA亚型分辨率研究不同的生物系统，并帮助了解许多疾病的复杂机制。

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空间代谢组发现新肌纤维亚型

骨骼肌是由四种不同代谢特征的肌纤维亚型组成的，在机体其他结构中存在一种超快收缩肌纤维 (SFMs)，是脊椎动物中收缩最快的肌肉类型，如眼外肌中就存在SFMs，这些细胞最显著的特征是代谢模式不同，既有超高糖酵解能力也有大量线粒体，以持续服务超快收缩频率。MALDI-MSI的空间代谢组学是近年来发展的一种带有空间信息的代谢物检测技术，但其在代谢物注释、鉴定及图像精准共配准等方面都面临着更大的挑战，而肌肉的结构相对简单、且肌纤维细胞的大小足以提供超过检测限的代谢物，是高分辨率空间代谢组的理想模型。

本文利用小鼠骨骼肌样本优化了样本制备过程，提高了单肌纤维的表面积，增强了离子丰度，并获得了高空间分辨率的肌纤维质谱图像。然后结合常规的LC-MS非靶向代谢组学分析进行交叉验证，产生了更可靠的空间代谢组学结果。在空间代谢组数据分析过程中第一次发现了2b mitohigh肌纤维亚型，其具有抗疲劳代谢及超快肌纤维表达的分子特征，解析了骨骼肌中肌纤维代谢亚型的异质性，丰富了对骨骼肌纤维亚型的认识，加深了对生理或病理条件下肌纤维重塑的理解。

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单细胞测序助力CD26阴性和CD26阳性的组织常驻成纤维细胞有助于区分乳腺癌中功能不同的CAF亚群

肿瘤发生不仅由基因改变的癌细胞本身控制，还由肿瘤微环境(TME)中的非恶性宿主细胞控制，后者强烈影响肿瘤进展、转移和治疗反应。TME中最主要的细胞类型之一是癌症相关成纤维细胞(CAFs)。CAFs大量存在于几乎所有肿瘤的微环境中，并强烈影响肿瘤进展。尽管对它们的功能和异质性有了越来越多的了解，但对CAFs的起源知之甚少。了解CAF异质性的起源是开发成功的基于CAF的靶向治疗的必要条件。

通过对小鼠的各种移植研究，研究者发现侵袭性小叶性乳腺癌和三阴性乳腺癌中的CAFs都起源于乳腺组织中的正常成纤维细胞(NFs)。体内和体外单细胞转录组学研究显示CD26+和CD26- NF群体分别转变为炎性CAFs (iCAFs)和肌成纤维细胞CAFs (myCAFs)。功能共培养实验表明，CD26+ NFs转化为促肿瘤iCAFs，以CXCL12依赖的方式招募髓细胞，并通过基质金属蛋白酶(MMP)活性增强肿瘤细胞的侵袭。

总之，研究者的数据表明CD26+和CD26- NFs在乳腺癌小鼠模型中转化为不同的CAF亚群。

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垂体瘤新分型有效预测远期复发

垂体瘤是人体常见的神经内分泌肿瘤，根据激素分泌和免疫组化，垂体瘤可分为10种亚型，但这些分型对于预测患者复发效果有限，并且垂体瘤的亚型繁多，各亚型的起源不明确，缺乏评估肿瘤分化程度的分子标志物，而肿瘤起源和分化程度对于预测预后效果非常重要。

本研究利用单细胞转录组测序对3例成人垂体前叶组织和21例垂体瘤组织共64,937个细胞进行检测，获得了垂体瘤的图谱，在其中PIT1谱系（垂体瘤的一种亚型）的细胞中有一群细胞不表达经典的垂体激素（GH、PRL、TSH），通过拟时间序列分析和RNA速率分析发现这群细胞在分化轨迹的最前端，具有分化为成熟GH、PRL、TSH的潜力，因此将这些细胞命名为PIT1祖细胞（Pro.PIT1），进一步比较正常垂体和垂体瘤的个亚群的特征及相似性打分将垂体瘤划分为高、低分化组，并对各自的特征基因、转录因子、通路等进行分析，最后为了验证垂体瘤分化分型对预后预测的价值，进行了800人的独立队列的生存分析，发现其预测效果优于Ki67，其中PIT1，TPIT的低分化组和肿瘤复发率高，而在SF1中则高分化组复发率更高，这样有趣的结果具体的机制还要进一步及逆行探索。

总之，该研究将分化程度引入垂体瘤的二分行策略，并指导复发预测的分子分型。

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空间转录组测序：增强海马神经发生改善阿尔茨海默病患者的记忆损伤

研究发现，在阿尔茨海默病（AD）患者和家族性阿尔茨海默病（FAD）小鼠模型中，海马神经发生受损。但目前对于新的神经元是否在记忆缺陷中起着诱发作用。

本研究通过空间转录组测序技术发现，未成熟的神经元在执行海马体依赖的任务后被积极地招募到记忆印记中，但是在FAD中招募严重不足。被招募的未成熟神经元表现出脊柱密度受损和转录谱的改变。在FAD小鼠中，靶向增强神经发生恢复了印记中新神经元的数量、树突棘密度以及未成熟和成熟神经元的转录特征，最终导致改善记忆损伤。AD患者神经发生增强后未成熟神经元的化学发生失活，逆转小鼠的表现，并记忆减弱。值得注意的是，AD-linked App、ApoE和Adam10是基因印记中最重要的差异表达基因。

总的来说，这些观察结果表明，神经发生损伤导致了AD的记忆失败。

参考文献 

1、Liao Y, Liu Z, Zhang Y, Lu P, Wen L, Tang F. High-throughput and high-sensitivity full-length single-cell RNA-seq analysis on third-generation sequencing platform. Cell Discov. 2023 Jan 11;9(1):5. doi: 10.1038/s41421-022-00500-4. Erratum in: Cell Discov. 2023 Feb 7;9(1):15. PMID: 36631434; PMCID: PMC9834245.

2、Luo L, Ma W, Liang K, Wang Y, Su J, Liu R, Liu T, Shyh-Chang N. Spatial metabolomics reveals skeletal myofiber subtypes. Sci Adv. 2023 Feb 3;9(5):eadd0455. doi: 10.1126/sciadv.add0455. Epub 2023 Feb 3. PMID: 36735792.

3、Houthuijzen JM, de Bruijn R, van der Burg E, Drenth AP, Wientjens E, Filipovic T, Bullock E, Brambillasca CS, Pulver EM, Nieuwland M, de Rink I, van Diepen F, Klarenbeek S, Kerkhoven R, Brunton VG, Scheele CLGJ, Boelens MC, Jonkers J. CD26-negative and CD26-positive tissue-resident fibroblasts contribute to functionally distinct CAF subpopulations in breast cancer. Nat Commun. 2023 Jan 12;14(1):183. doi: 10.1038/s41467-023-35793-w. PMID: 36635273; PMCID: PMC9837080.

4、Zhang Q, Yao B, Long X, Chen Z, He M, Wu Y, Qiao N, Ma Z, Ye Z, Zhang Y, Yao S, Wang Y, Cheng H, Chen H, Ye H, Wang Y, Li Y, Chen J, Zhang Z, Guo F, Zhao Y. Single-cell sequencing identifies differentiation-related markers for molecular classification and recurrence prediction of PitNET. Cell Rep Med. 2023 Feb 3:100934. doi: 10.1016/j.xcrm.2023.100934. Epub ahead of print. PMID: 36754052.

5、Mishra R, Phan T, Kumar P, Morrissey Z, Gupta M, Hollands C, Shetti A, Lopez KL, Maienschein-Cline M, Suh H, Hen R, Lazarov O. Augmenting neurogenesis rescues memory impairments in Alzheimer's disease by restoring the memory-storing neurons. J Exp Med. 2022 Sep 5;219(9):e20220391. doi: 10.1084/jem.20220391. Epub 2022 Aug 19. PMID: 35984475; PMCID: PMC9399756.

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