贴壁细胞的分瓶操作步骤

1.从细胞单层吸出培养基。

2. 缓慢加入37’C 温浴的PBS 或不含血清的培养基，让培养基沿容器壁流下，注意不要滴在细胞上，以免冲掉附着不牢的细胞。

3. 再吸出PBS 或培养基。

4. 加入含0.25 ％胰蛋白酶的PBS, 加入蜇以刚刚没过细胞为宜。

5. 立即吸去胰蛋白酶，停留在细胞上的时间为10 ~ 30s(可以用不含血清的旧培养基多洗细胞几次，以除掉痕量的血清，血清的存在会抑制胰蛋白酶的活性）

6. 室温放置5 – 15 min, 每隔几分钟观察容器晃动时单层细胞是否产生滑动。如果是，可以进行下一步实验，如果不是，可以37°C 保温5 min 。

7. 加入与开始时等体积的新鲜培养基，并吹打细胞使细胞分散，在倒置显微镜下确认得到的是游离的单个悬浮细胞。

8. 吸出1 ml 细胞悬浮液至微型离心管中。

9. 对细胞进行计数。

10. 计算出推荐培养浓度的稀释倍数。

11. 吸出适量的细胞至新培养瓶中。

12. 加入适量3 7°C 的新培养基。

13. 轻轻晃动培养瓶，使细胞均匀分散在表面。

14. 把细胞放入培养箱，拧松盖子。

（tip: 如果你使用100 cm 的培养皿，注意区分组织培养皿和细菌培养皿，细胞是不能附着在未经处理的细菌培养皿上。）

eg: 细胞计数得到1.0 X 106细胞／ mL, 而种子液浓度为105细胞／ ml, 最终细胞液的体积为10 ml, 那么原液就必须稀释10 倍，也就是1 ml 原液加入到9ml 的新培养基中。