单细胞杂记

1. 单细胞3个输入文件含义

单细胞3个的输入文件：

1. barcodes.tsv。表示细胞，行数是细胞数。
2. genes.tsv。表示基因，行数是基因数。
3. matrix.mtx。

单细胞3个输入文件含义。该数据是pbmc。

UMI：unique molecular identifier, 12 nt 定位分子。
BC：Barcode, 16nt，定位细胞，区别不同的细胞。
序列长度是根据细胞数量和分子数量来设计的，分别为,

2. FindVariableFeatures()选取高变基因方法vst和mvp的区别

mvp是自动选取最合适的高变基因数目，故如果选用了mvp，就不用设置nfeatures。

3. 关于样品总量：制作细胞悬浮液后，一个样本的最少细胞数目应为多少？若样品中细胞数目较少，对洗涤次数的要求是怎样的？

样本类型和制备，关键是要获得分离良好的细胞悬液、无细胞碎片、极少的细胞团块，且细胞活力高(>70%)。了解您所研究细胞的大小范围也很重要。

实验所需的细胞数量取决于样本预期的细胞异质性、样本中的细胞数、细胞亚群预期的最低频率,以及数据分析所需的每种细胞类型的最低数量(详见在线工具: https://satijalab.org/howmanycells/）
假设有 10 种稀有细胞类型，每种细胞只占总细胞数的 2%。 如果我们想要 95% 确信我们的样本中每种细胞类型至少包含 5 个细胞，则总共需要至少采样 619 个细胞。

如果样品中细胞数目较少，您可能需要增加洗涤的次数来获取更纯净的细胞。洗涤细胞的目的是去除细胞培养基中的残留物和杂质，以确保实验的准确性和可重复性。通常情况下，建议进行至少3次洗涤步骤。每次洗涤可以采用适合的缓冲液（如PBS）进行，同时通过旋转离心或抽取上清液的方式去除沉淀物。更多的洗涤次数可能会进一步提高洗涤效果，但需要权衡时间和资源成本。

4. 单细胞测序过程中，对细胞的活性有无要求？至少要有多少比例的细胞保持活性？

细胞活性70%

5. 单细胞测序样品制备过程中，对于细胞直径过大的样品，如何制备悬液？

大的细胞团块或碎片会增加微流体芯片的堵塞风险，并且干扰准确的细胞计数，从而影响细胞回收，特别是在使用自动细胞计数器时。为了避免这一问题，应将细胞悬液上样到微流体芯片之前，使用孔径为30-40μm的细胞过滤网。

细胞大小通常与细胞表达的转录本数量有关。各种尺寸不同的细胞(直径不大于30μm)。

值得注意的是，每次过滤都会导致细胞悬液体积的减少以及细胞浓度的变，在过滤完成后对单细胞悬液进行重新计数。

6. 如果一个样本用福尔马林保存了十数年，能否用这个样本做单细胞测序？如果可以的话，需要什么特别的操作？