1. Author

Jayanta Bhattacharya

Jayanta Bhattacharya就职于印度转化健康科学技术研究所。主要从事艾滋病与新冠抗体的开发工作。现发表诸多高质量文章，例如：Effectiveness of ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2 infection during the delta (B.1.617.2) variant surge in India: a test-negative, case-control study and a mechanistic study of post-vaccination immune responses等等。

2. Background

SARS-CoV-2是一种单链RNA病毒。因为COVID-19的病原特点，已导致全球500多万人死亡。一些VOCs获得了突变，使它们具有选择性优势，要么更高的传播率，要么对疫苗反应产生抗性。在所有的SARS-CoV-2 VOCs中，2020年末印度马哈拉施特拉邦首次发现的Delta变种(B.1.617.2)很快成为全球主要的流行毒株。后续出现了Omicron等致病性更强的突变株。不幸的是，疫苗获得有限的国家面临COVID-19病例率较高和住院人数增加，这可能使卫生系统不堪重负，并增加因COVID-19而不断增长的发病率和死亡率。

在新冠大流行最严重的时候，由于缺乏有效的小分子药物，人们开发了单克隆抗体(mAbs)，作为一种相对快速的预防住院治疗的对策。礼来和再生元在8个月时间内将单克隆抗体从发现到获得紧急使用许可(EUA)。这些单克隆抗体对不同的VOCs具有不同的活性，包括bamlanivimab对Delta和Beta变种的中和活性丧失，fetesivimab对Beta变种的中和活性丧失和降低活性，以及casirivimab对Beta变种的活性降低。Imdevimab与Casirivimab联合使，对Alpha、Beta和Delta变体仍然有效。然而，新的Omicron变体似乎对所有四种EUA抗体都具有耐药性。这些发现强调了从对新的挥发性有机化合物有效的恢复期供体中分离新的单克隆抗体的价值，为预防严重的COVID-19疾病提供了额外的治疗选择。

3. Methods

1. 流式细胞术分选抗原特异性记忆B细胞

2. 可变重、轻IgG链的扩增与克隆

3. ELISA检测抗体表达

4. 链霉亲和素ELISA检测SARS- CoV-2 (RBD)抗体

5. 抗体的纯化表达

6. 微量中和筛查法

7. 假毒实验

8. 活病毒减毒中和试验(FRNT)

9. 细胞表面刺突结合试验。

10. 抗体-RBD竞争实验

11. BLI

12. X-射线晶体衍射

13. 负染电镜

14. RT-PCR

4. Results

实验团都收集了11个新冠康复者的队列，利用血清通过高通量筛选、ELISA以及假毒实验筛选得到了一个拥有高中和能力的康复患者（C-03-0020）。紧接着通过RBD蛋白作用抗原，结合流式细胞术筛选得到了分泌RBD抗体的B细胞。利用RT-PCR以及测序，得到结合抗体的重轻链序列。表达纯化以后，进行ELISA与突变体假毒中和等实验，锁定了5个抗体，其中THSC20.HVTR39是一种SARS-1与SARS-2的交叉抗体。

恢复期患者记忆B细胞中和抗体的分离

针对筛选得到的5个抗体进行RBD的结合测试，发现THSC20.HVTR04和 THSC20.HVTR26具有最高的结合。为了保证实验的严谨性，后续实验团队利用完整的三聚体蛋白作为抗原，表达在细胞表面来检测结合能力。得到了一样的结果。

对于突变株作为抗原的中和实验表明，THSC20.HVTR04和 THSC20.HVTR26同样可以中和Alpha, Beta, Delta 和 Kappa。但是对于Omicron而言，逃逸了THSC20.HVTR04但是仍然被THSC20.HVTR26中和。

筛选得到抗体对突变株的中和能力

从结构生物学表位的角度，作者试图探究这些候选抗体的一个结合角度。利用竞争BLI实验，发现：①THSC20.HVTR88与THSC20.HVTR04拥有相同的表位。②THSC20.HVTR04、REGN10987、CC6.33.1的表位相同，而THSC20.HVTR26、REGN10933、CC12.1的表位相同。与此同时，与ACE2的竞争性ELISA中，THSC20. HVTR04和 THSC20.HVTR26与ACE2竞争性抑制病毒。其中THSC20. HVTR04被N439K, N440K和K444N位点突变逃逸但THSC20.HVTR26不被上述突变逃逸。

其中值得注意的是THSC20.HVTR26虽然是IGHV3-53家族的抗体，但是结合模式与传统的3-53有着不同。THSC20.HVTR26副翼主要由CDR-H2、-H3和-L3残基组成，占界面的80%。其作用位点主要涉及G485, F486和N487这几个残基。另外的E484与T487也是发挥着重要的作用（这些位点在β与Δ株中发生了突变）。

THSC20.HVTR04的作用位点更均匀地分布在所有6个CDR上。SARS-CoV-2 RBD的V445和P499位点完全埋藏在THSC20.HVTR04中。其他重要的相互作残基还有： N439, N440, S443, K444,G446, G447和T500。其中只有N440K和G446S被发现存在于突变株中。

负染电镜结果图

在后续的小鼠实验中发现筛选得到的THSC20.HVTR88与THSC20.HVTR04的体内作用良好。无论实在小鼠体重的减少程度还是肺部病毒载量，与对照组相比都有良好的改善。

体内保护效果图

5. Discussion

作者：Nitin Hingankar

通讯作者：Jayanta Bhattacharya

单位：IAVI HIV Vaccine Translational Research Laboratory, IAVI-THSTIpartnership program, Translational Health Science & Technology Institute,NCR Biotech Science Cluster, Faridabad, India

年份：2022.8.28

期刊：PLOS Pathogens

科学问题： 从印度本地的新冠康复患者中分离得到一种抗体组合，可以达到中和变异株Delta的目的。

结论：从康复者中分离得到的THSC20.HVTR04与THSC20.HVTR26非常有临床潜力。其中的THSC20.HVTR04可以 中和除Omicron外大部分的变异株，而THSC20.HVTR26（IGHV3-53）以特殊的结合角度中和Omicron。二者以0.625 mg/kg的剂量联用可以做到完全保护小鼠免于新冠病毒。