最新8+单细胞测序结合bulk测序纯生信。小编教你如何模仿并超越本篇文章。

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影响因子：8.7

本文的思路是通过单细胞数据分析识别了某种免疫细胞特有的marker基因，然后利用这些基因进行预后模型的构建。事实上，预后模型的文章已经不好发了，甚至有的审稿人看到预后模型就反感，因为实在是太多了，而且预测效能普遍不行。那么如何做的比这篇文章还要好呢？鉴于最近泛癌分析以及肿瘤分型分析比较好发，小编做的免疫细胞marker的泛癌分析以及肿瘤分析均在本月发表到8+杂志。所以我们在筛选到某种免疫细胞特有的marker基因后，可以对这些基因进行泛癌分析或者肿瘤分型分析。在分型分析中再附上简单的预后模型，但不以其为重点。这样的思路肯定是比本篇文章内容更多，更新颖。如果想做类似分析，欢迎交流。
研究概述

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中肺腺癌（LUAD）是肺癌最主要的组织学亚型，其5年总生存期（OS）低于20%。近年来，免疫疗法的临床应用显著提高了LUAD的临床疗效。自然杀伤（NK）细胞是先天免疫细胞的一种亚型，可以快速识别并杀死肿瘤细胞。同时，NK细胞还可以通过直接杀死肿瘤细胞和促进适应性T细胞免疫反应，在肿瘤早期参与抗肿瘤免疫，从而限制肿瘤细胞的侵袭性，降低恶性肿瘤的风险。

在这项研究中，作者首先对LUAD的scRNA-seq进行了全面分析，以剖析肿瘤浸润NK细胞的分子特征并识别标记基因。随后，作者构建了一个NK细胞标记基因特征（NKCMGS），并分析该特征与LUAD预后和免疫治疗反应之间的关系。

流程图

研究结果

一、识别NK细胞标记基因

1、基于GSE131907的scRNA-seq数据，从11个LUAD样本中获得了45149个细胞的基因表达谱，用于进一步分析（下图A）。

2、使用前1500个可变基因进行主成分分析，鉴定出17个细胞集群（下图B）。随后，对每个集群的细胞进行注释，鉴定出NK细胞（下图C），其中有189个基因存在差异表达（下图D），被鉴定为与LUAD相关的NK细胞标记基因。

二、基于NK细胞标记基因的七基因预后特征的建立

1、使用Cox回归和LASSO回归分析筛选出7个基因构建LUAD预后特征（NKCMGS）。利用风险评分中位值将患者分为低风险和高风险组。下图A显示风险评分和生存状态的分布，可以看出高风险组的死亡人数更多。下图B则显示7个NK细胞标记基因的表达情况。

2、Kaplan-Meier分析表明，高风险评分患者的OS显著低于低风险评分患者（下图C）。ROC曲线下面积，1年、3年和5年的AUC值分别为0.710、0.725和0.730（下图D）。

三、验证NKCMGS在不同队列中的预后性能

1、纳入6个独立的GEO队列，这6个GEO队列的临床特征如下表1所示。计算6个GEO队列中每位患者的风险评分，根据中位风险评分将患者分为高风险组和低风险组。

2、Kaplan-Meier分析表明，在所有6个GEO队列中，高风险组的预后均低于低风险组。GSE30219（下图A)，GSE3141（下图B），GSE50081（下图C），GSE26939（下图D)，GSE72094（下图E）和GSE31210（下图F）。

3、6个GEO队列中风险评分的ROC曲线也显示出良好的性能，可见NKCMGS是LUAD患者的重要预后指标（下图G）。

四、NKCMGS对LUAD患者的独立预后作用

1、使用TCGA数据库中LUAD患者的临床特征、分子因素和风险评分进行单变量和多变量Cox回归分析。多变量Cox回归分析结果证明，NKCMGS的风险评分是一个独立的预后因素（下表2）。

2、对风险评分和所有临床特征进行LASSO回归分析。结果表明，风险评分和肿瘤分期是LUAD预后的最佳预测因素。

五、NKCMGS相关基因的功能富集分析

1、为了阐明NKCMGS预测能力的潜在机制，作者研究了与NKCMGS相关的生物学途径（下图A）。GO分析显示这些基因主要涉及有丝分裂和有丝分裂细胞周期的G2/M期调控（下图B）。KEGG分析证实这些基因与细胞周期途径密切相关（下图C）。

六、NKCMGS与免疫细胞浸润

1、使用ESTIMATE算法，发现高风险患者的免疫评分、基质评分、综合评分和肿瘤纯度均高于低风险患者（下图A-D），这表明风险评分与免疫细胞浸润水平密切相关。

2、CIBERSORT分析显示，高风险患者中的静息NK细胞、M0巨噬细胞、M2巨噬细胞、活化的树突细胞和肥大细胞比例较高，但浆细胞、CD8+T细胞、滤泡辅助T细胞、调节性T细胞、静息树突细胞和静息肥大细胞的比例较低（下图E）。

3、下图F显示高风险组和低风险组之间不同免疫细胞的比例。作者进一步进行风险评分与免疫细胞浸润之间的相关性分析。结果表明，风险评分与巨噬细胞和中性粒细胞呈正相关，但与T细胞、B细胞和肥大细胞呈负相关。

七、NKCMGS可以预测LUAD患者的免疫治疗反应

1、分析TCGA数据库LUAD队列中NKCMGS与免疫治疗生物标志物（PD-L1表达和TMB）之间的关系。结果表明，PD-L1表达在低风险和高风险患者之间没有显著差异，但低风险患者的TMB明显低于高风险患者（下图A-B）。此外，作者还发现低风险患者的T细胞受体（TCR）丰富度和多样性显著高于高风险患者（下图C-D）。

1、研究招募了298名IMvigor210队列中接受抗PD-L1治疗的患者进行分析。Kaplan-Meier分析显示免疫治疗后高风险患者的生存率较低（下图E）。低风险评分与对抗PD-L1治疗的客观反应相关（下图F）。低风险组抗PD-L1治疗的客观缓解率显著升高（下图G）。

3、ROC曲线显示，TMB、PD-L1和风险评分模型联合预测抗PD-L1反应的准确率为76.1%，优于TMB（AUC=0.728）、PD-L1（AUC=0.569）或单独的风险评分（AUC=0.603）（下图H）。这些发现表明低风险评分的患者更有可能从免疫治疗中受益，而NKCMGS可能是识别从免疫治疗中受益的LUAD患者的生物标志物。

总结

作者基于TCGA和GEO队列中的NK细胞标记基因开发了一种七基因预后特征（NKCMGS），该特征的预测能力在不同的临床亚组和队列中得到了验证。最终结果显示，NKCMGS具有预测LUAD患者预后和免疫治疗反应的强大性能，可以作为关于LUAD个体化预测及临床决策的预后生物标志物，并有助于选择可以从免疫治疗中受益的合适患者。