Trizol法提取总RNA的流程

1.样品处理：

培养细胞：收获细胞1~5×107，加入1ml Trizol（异硫氰酸胍/酚）（在冰箱旁边取出白细胞即刻加入Trizol），混匀；用1ml注射器反复抽取（约30次）以破裂细胞及剪切DNA，室温静置5min（使核酸蛋白复合物完全分离）。

组织：取50~100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置5ml EP管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置5min。

2.可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

3.加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15~30s，静置2~3min。

4.4℃离心，12000g×15min。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

5.小心吸取上清至一新的DEPC处理过的1.5ml EP管中（如要分离DNA和蛋白质可保留有机相），加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。

6.4℃离心，12000g×10min。离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。

7.弃上清，于沉淀中加入75%乙醇（冰冷）1ml，振摇，充分洗涤沉淀。

8.4℃离心，12000g×5min。

9.弃上清，短暂离心，小心吸取弃去上清。

10.加入适量（20μl）DEPC （Rnase Free）H20溶解RNA（65℃促溶10~15min）。

11.取2μl进行电泳，其余-80℃保存。