1. Author

Tomoharu Yasuda目前就职于日本广岛大学，主要从事以抗原受体、信号传导、分化增殖的控制分子为轴心的免疫作用机制，致力于解决感染症、癌症、过敏、自身免疫、老化、组织再生等课题。

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2. Background

2.1 TMPRSS2

疫情暴发后不久，科学家们就发现病毒入侵的两个关键分子：SARS-CoV-2的刺突蛋白可与人体细胞表面的血管紧张素转化酶2（ACE2）受体蛋白结合， 而人体细胞中跨膜丝氨酸蛋白酶（TMPRSS2），是一种可切割ACE2和刺突蛋白的细胞表面蛋白酶，在病毒入侵过程中发挥了“助攻”作用：激活冠状病毒的刺突蛋白，为SARS-CoV-2进入细胞提供便利。

2020年1月31日，德国哥廷根大学生物与心理学学院Stefan Pöhlmann研究团队揭示了SARS-CoV-2入侵宿主细胞的完整分子链，TMPRSS2启动突刺蛋白，进而突刺蛋白与ACE2结合进入宿主细胞。

研究人员发现TMPRSS2抑制剂可以明显抑制2019-nCoV突刺蛋白进入表达TMPRSS2的细胞系，而促进TMPRSS2表达可以取消这种抑制作用，这就说明2019-nCoV突刺蛋白依赖于TMPRSS2启动。

2020年3月5日，德国哥廷根大学Stefan Pöhlmann、Markus Hoffmann等研究人员在Cell上联合发表题为"SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor" 的研究论文。研究人员证明了新冠病毒使用SARS-CoV受体ACE2进入细胞，并且丝氨酸蛋白酶TMPRSS2用于突刺（S）蛋白的活化。阐明新冠病毒使用哪些细胞分子来进入，可能会为病毒的传播提供见解并揭示治疗靶标。

后续科学家团队找到了三类最有可能受新冠病毒直接攻击的细胞类型：第一种是鼻腔里的杯状分泌细胞（goblet secretory cells），它们平时的功能是分泌鼻涕；第二类是肺部的Ⅱ型肺泡细胞（type II pneumocytes），负责维持肺泡的功能；第三类细胞来自消化道，叫做吸收性肠上皮细胞，位于小肠上，负责营养物质的吸收。只要一种细胞同时表达ACE2和TMPRSS2，它被新冠病毒感染的风险就非常高。这一发现对于需要开展细胞实验来筛选药物的各类研究有着重要意义。

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3. Methods

1. 康复者与健康者样本血液采集

2. 流式细胞分选得到Spike特异性的B细胞

3. 单细胞测序和单克隆抗体的表达

4. Spike蛋白与RBD的重组表达

5. ELISA

6. 生物膜干涉实验（BLI）

7. 真毒假毒中和实验

8. 病毒RNA测序

9. X射线晶体衍射

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4. Results

实验团队选取了武汉原始株确诊8-55天的病人作为队列研究，发现患病超过17天的病人体内存在浓度较高的中和抗体。但是这些抗体在面对Omicron突变株的时候失去了中和活性——除了两个高龄患者体内存在着有一定活性的中和抗体。在分选得到分泌抗体的B细胞，并通过细胞测序得到抗体序列后发现：① 超过10%的抗体属于IGHV3-30, IGKV1-5, 和 IGKV3-20家族。②102个抗体中IGG1占据绝大多数。 ③77%的抗体经历了体细胞高频突变。进一步的真毒中和实验发现潜在的4个抗体具有良好的中和活性——NCV1SG17, NCV1SG23, NCV2SG48, 和NCV2SG53。

后续针对这4个抗体进行了不同突变株的结合能力测定，发现：① 他们皆不受K417, L452和E484突变的影响；②NCV1SG23 和 NCV2SG48可以和所有的突变株很好的结合但是NCV1SG23对Omicron BA.1的结合能力下降严重。中和实验基本和结合实验一致，但是也存在一些有趣的现象：①NCV1SG17和NCV2SG53对Beta与Omicron的中和活性完全丧失； ②NCV1SG23和NCV2SG48具有良好的广谱性；③NCV2SG48 和NCV2SG53的混合疗法可以中和所有突变株。

紧接着实验团队想通过结构生物学的手段，对这两个潜在的中和抗体进行结构方面的机制阐述。通过X射线发现NCV2SG48和NCV2SG53都是竞争性结合ACE2——分别属于1类和2类家族。其中NCV2SG48的接触面积比传统的中和抗体都要大，体细胞突变是的NCV2SG48与RBD多了5个相互作用的位点。当回补这些突变以后发现中和能力陡然下降。NCV2SG48 HC的接触面积武汉株、Omicron BA.1相当，而LC结合面积减少了约22% ——这可能是因为N501Y和Q498R。NCV2SG53则更容易受到E484的影响，因为他的6个相互作用位点位于E484周围。另一方面，如Delta突变具有L452R/T478K，没有减弱NCV2SG53的中和活性。

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5. Discussion

作者：Kiyomi Shitaoka

通讯作者：Tomoharu Yasuda

单位：Department of Immunology, Graduate School of Biomedical and HealthSciences, Hiroshima University, Hiroshima, Japan.

年份：2023.04.11

期刊：Communications Biology

科学问题：被早期毒株感染的恢复期个体产生广谱中和抗体的频率如何，以及这些抗体如何对包括Omicron在内的突变株发挥中和作用？

结论：从原始株（D614G）康复者中分离得到的抗体中，NCV1SG23和 NCV2SG48可以中和Omicron。随着时间的推移，康复者体内的抗体SHM也随之增加，这表明广谱抗体是通过GC反应产生的，同时抗体的广谱性可能是因为GC中CDR区域SHM反应。感染康复者中几乎所有的RBD家族抗体都失去了中和活性，只有家族1的NCV2SG48因为作用位点相对保守，所以仍然有较好的效力——NCV2SG48与RBD复合体几乎完全覆盖RBM的超大界面，可以阻断与ACE2的构象相互作用。NCV2SG48是IGHV3-53家族的一员，并且优先在轻微反应者中被诱导起来。由于显著较高的中和活性仅在长期住院的供体中检测到，所以抗体强大广泛的中和一定与持续的SHM有关。令我们惊讶的是，我们可以从87岁和93岁的捐赠者中分离出bnab，尽管人们普遍认为老年人出现严重症状或死亡的风险较高。因此，在老年人中产生中和抗体的能力是否与临床结果相关是很有趣的。总的来说，激活和召回具有广泛反应的B细胞可能会保护机体免于突变株的侵害。目前的结果将有助于开发对抗SARS-CoV-2变异的疫苗和疗法。