电转染转染使用方法小技巧

有些学生会疑惑，为什么严格按照实验流程来操作实验，也没有得到预期的结果。其实还可以通过优化和调整电穿孔实验来得到你想要的效果。一般优化可从几方面下手：制备细胞和DNA的方法，电穿孔本身，以及之后如何处理细胞。接下来我们来科普一下：

一些细胞，如HeLa细胞，很容易用脂质体转染。而其他细胞，如干细胞、原代神经元和未受刺激的T细胞和B细胞，则没那么简单。对于这些细胞而言，电穿孔逐渐成为首选方法，而研究人员也会采取更复杂的方法作为备份，如病毒转导。NEPA GENE NEPA21产品经理曾说：电穿孔仪过去是以提供单一的大幅电脉冲来打开细胞，让外来物质通过布朗运动而扩散进去。这个过程很剧烈，往往留下很多死细胞，比已转染的细胞还多。如今NEPA21是采用专利四步法程序，低电压多脉冲，可以改变电击的各个参数，保证细胞转染效率更高，对细胞的伤害也更小。

培养条件

细胞应该是健康的，没有支原体。问题可能在于细胞在制备过程中受到损伤，而施加电脉冲只会让情况更加恶化。因而制备细胞过程中，应注意：

1. 待转的细胞最好处于对数生长期，因为DNA更容易进入积极分裂的细胞。这也是原代、不分裂的细胞很难转染的原因之一。然而，即使是这些不分裂的细胞，只要操作一致，也会有好的结果。

2. 适当降低离心速度，改善细胞损伤。

3. 对于一些消化酶的使用，如胰酶，有时也会对电穿孔产生不利影响。

4. 当您开展任何一种转染时，去除抗生素和血清也很重要，之后可继续使用。

另外，研究人员常常抱怨电穿孔的转染效率不稳定，其实很多因素往往不一致，例如细胞批次不同，细胞状态不好等。建议优化那些步骤，同时锁定单个参数。

按照类似的思路，如果原代人类T细胞转染不顺利，那也许是在于细胞的供体。因此，我们可以再试一次，采用另一位供体，看是不是有所改善。细胞系在多代之后会改变其属性，因此，若转染效率不符合预期，则应该考虑一下从ATCC买个新鲜的。

电击

与脂质体转染相比，电穿孔有其独特的优势，脉冲不仅能在外膜上开孔，也能在核膜上产生缺口。

现代的电穿孔仪能够控制脉冲的持续时间、幅度（电压）、数量，甚至是极性和波形。例如，NEPA GENE NEPA21，让用户能够单独控制每个参数。制造商通常也有一个数据库，提供特定细胞类型的建议设置，您可在这个基础上优化和调整。

其他系统，包括MaxCyte和Amaxa Nucleofector，则被认为是黑匣子。根据该公司的优化数据库，用户得到了特定细胞类型的代码。它编码的各个参数，以及缓冲液的组成，仍然是个秘密。

其实，如何提供电压脉冲非常关键。使用错误的参数会导致细胞死亡。除非你是个生物物理学方面的专家，否则你真的不知道如何玩转那些不同的变量。如果结果不符合预期，您可以致电技术支持，他们将提供故障排查的协助，或者尝试另一种参数设置。

当然，一定要使用对照。在致电技术支持时，第一个问题可能是：厂家提供的对照质粒结果如何？如果不好，那问题可能出在DNA。一般建议使用无内毒素DNA制备试剂盒。还有，质粒上的内部核糖体进入位点（IRES）序列和长的重复可能也有不利影响。

DNA是客户需要优化的唯一东西。需要注意：

① 浓度高一些：1ug/ul以上

② 纯度好：OD260/280≈1.8（需控制在1.8-2.0之间）

③ 去除内毒素

④ 质粒完整性：电泳检测质粒是否断裂，否则转染进入细胞也不表达。

⑤ 其他（针对特定细胞，质粒构建可能还会有特殊需求，比如启动子的选择等）

另外，大量DNA将带来高的转染效率，但也会降低细胞活性，因为大量DNA对细胞而言是有毒的。同样，包含多个基因的大质粒（如iPS细胞重编程中使用的那些）也会使效率降低。建议使用多个、较小的质粒。

转染之后

细胞在转染之后被如何处理也会有影响，例如它们被放入何种培养基中，铺板的密度如何，甚至孵育温度如何。一般建议尽快将细胞放回培养箱培养，“越早放回去，它们会越健康，细胞活力也更好”。

细胞活力和转染效率通常在转染后24小时测定，让细胞有时间恢复，并表达蛋白。

如果经过一切优化和调整，表达目的蛋白的健康细胞数量仍达不到您的要求，那么试试RNA。它不需要进入细胞核就能表达，因此，当DNA转染失败时，mRNA或siRNA转染有时却能成功。