6+非肿瘤生信，免疫浸润+PPI网络+Friends分析+实验验证，可重复！

生信小课堂

影响因子：6.081

关于非肿瘤生信，我们也解读过很多，主要有以下类型
1 单个疾病WGCNA+PPI分析筛选hub基因。
2 单个疾病结合免疫浸润，铁死亡，自噬等基因集，机器学习算法等。
3 两种相关疾病联合分析，包括非肿瘤结合非肿瘤，非肿瘤结合肿瘤或者非肿瘤结合泛癌分析
4 基于分型的非肿瘤生信分析

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研究概述：

黄韧带肥大(LFH)是导致椎管狭窄的常见原因。本研究利用GEO数据库筛选并确定了关键DEGs和信号通路，对其进行GO、KEGG、PPI网络分析以及进一步的免疫细胞浸润和Friends分析得出其中的关键基因。最后，利用实时荧光定量PCR和IHC在体外人LFH组织中对结果进行了验证。本研究的发现可能导致新的治疗靶点和临床方法，因为它们提供了对LFH的分子机制的见解。

研究流程图：

研究结果：

一、免疫细胞浸润分析

1、首先对数据进行规范及分布：比较老年LFH组织和年轻正常LF组织中的基因表达水平进行标准化分析发现，两组的基因表达值均观察到相似的分布（图2A，B）。

2、使用CIBERSORT算法计算22种免疫细胞在老年LFH组织和年轻正常LF组织的浸润程度发现，激活的CD4 T细胞和B细胞的比例显示LFH组和正常LF组之间存在显著差异（图3A）

3、LFH组记忆激活CD4 T细胞和幼稚B细胞的浸润明显低于正常LF组，其余20种免疫细胞类型的比例在两组间没有显著差异。记忆激活的CD4 T细胞与naive B细胞、M1巨噬细胞和CD8 T细胞呈显著正相关（图3B）。

二、差异表达基因筛选及分析

1、从GSE113212数据集中获得了1530个已鉴定的DEGs。从ImmPort数据库下载的1793个免疫相关基因列表与鉴定出的DEGs重叠，得到LFH的免疫相关DEGs。（图4A-D）

2、GO分析显示，白细胞活化、T细胞活化、白细胞趋化、BP、溶酶体膜、MHC蛋白复合物等功能途径显著富集；KEGG分析表明，DEGs在蛋白消化吸收、细胞因子-细胞因子受体相互作用、PI3KAkt信号通路、Th17细胞分化等生物途径中富集。（图4E）

3、其中最显著富集的途径是ECM-受体相互作用和免疫相关途径Th17细胞分化（图5A-B）。

三、基因集富集分析和基因集变异分析

1、GSE113212数据集中，受影响最大的反应组通路是白细胞介素、天冬酰胺连接糖基化、淋巴细胞和非淋巴细胞之间的免疫调节相互作用；受影响最大的KEGG途径是肠道免疫网络的IgA产生和微RNA参与脓毒症的免疫反应，以及其他生物学相关的途径（图6A-E）

2、GSVA分析表明，在疾病组最影响反应途径是CREB3激活基因，n-乙酰成员的合成等等；在正常LF组中，反应组通路POLB依赖的长补丁碱基切除修复主要受到影响。（图6F）

四、PPI网络分析、Friends分析及免疫浸润相关性分析

1、首先，构建PPI网络，与其他LFH免疫相关DEGs相互作用最多的前5个DEGs分别是TNF、IL6、IL10、EGFR和LEP。鉴定出其中的两个关键模块，使用模块1中的27个基因作为与LFH免疫相关的关键DEGs。（图7A-D）

2、与LFH免疫相关的关键基因在两组中存在差异表达，BDNF、CSF3和LEP基因的ROC曲线表明这三个基因有区分LFH组和正常LF组的潜力（图8A-B）

3、Friends分析显示，TNF超家族成员11（TNFSF11）与其他DEGs的相关性最强，因此可能在LFH免疫中发挥关键作用（图9）

4、LFH免疫和免疫细胞浸润相关的关键LFH之间的相关性具有显著的相关性（图10）

五、实验验证生物信息学的结果

qRT-PCR显示，LFH组织中IL-6、IL-10、LEP和TNF-α的mRNA水平显著高于正常LF组织，但两组间EGFR mRNA表达量差异无统计学意义，IHC结果也得出了一致的结论。证实了生物信息学的可靠性。（图11-12）

研究总结：

本文利用GSE113212 LFH数据集的综合生物信息学研究确定了LFH的关键基因及相关的分子通路，并通过qRT-PCR和IHC证实了在人LFH组织中IL-16、IL-10、LEP和TNF-α的高表达水平。在这项研究中，发现了以前在黄韧带肥大中没有报道过的免疫浸润T细胞、CD4记忆激活和B细胞。丰富的细胞因子活动和PI3K-Akt信号通路与LFH高度相关。本文将为LFH的分子机制研究提供新的见解。