ChIP-seq下游分析之motif 分析

什么是ChIP-seq？

ChIP-Seq即染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）与二代测序技术的结合，通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化和文库构建，然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。能够在全基因组水平研究蛋白结合靶DNA序列，特别是在转录因子、组蛋白修饰等表观遗传学的研究中发挥重要作用。

图1　ChIP-seq流程

什么是motif分析？

Motif是一段有特征的典型DNA短序列，中文翻译称为基序或模体，拥有生物学功能的保守性，包含特异性的结合位点，涉及某一个特定生物学过程。motif分析就是解析目标区域具有保守性的DNA结合位点，鉴定这些位点与靶基因之间存在的相互作用关系，从而更好地研究某一疾病发生发展的分子机制。

图2 motif logo示例

Motif分析的软件有很多种，较为常见的MEME和Homer两种。本次主要为大家介绍Homer进行motif分析的主要步骤及原理。

Motif分析输入的数据一般是ChIP-seq流程过程中MACS2 进行callpeak之后的bed（narrawPeak或broadPeak）文件，也可以是自己人为整理的感兴趣区域bed文件。

narrawPeak文件示例：

第1列表示染色体号

第2列表示peak起始位点

第3列表示peak结束位点

第4列表示peak name

第5列表示peak score

第6列表示链方向strand 用+/- 表示链或者方向。如果是“.”则代表没有指定方向

第7列表示signalValue 测量该地区的总体（通常是平均）浓缩度，也可以成为富集倍数（fold enrichment）

第8列表示-log10（pValue）

第9列表示-log10（qValue）

第10列表示峰值

如何安装和使用Homer（Linux操作系统）？

Homer软件目前已经可以使用conda直接进行安装，所以直接使用conda 安装命令即可：

conda install -c bioconda homer

使用Homer进行motif分析需要先安装下载对应的基因组，安装基因组需要用到configureHomer.pl。

如果是conda安装的homer，该脚本位于~/anaconda3/pkgs/homer-***/bin文件夹下，可使用which homer进行查找。使用的参考基因组是人的hg38版本：

perl configureHomer.pl -install hg38

findMotifsGenome.pl 命令用于在基因组区域中寻找富集 Motifs :测试文件来自文章《Predicting FOXM1-Mediated Gene Regulation through the Analysis of Genome-Wide FOXM1 Binding Sites in MCF-7, K562, SK-N-SH, GM12878 and ECC-1 Cell Lines》的附件2中的MCF7的FOXM1 ChIP-seq结果，复现文章中Figure 1B的MCF7细胞系motif分析结果，其余结果仅仅是换一个输入文件即可。

findMotifsGenome.pl test_homer.bed hg38 out_motifDir -size 150 -mask

# 参数解释

-输入文件：处理好的 Peak/Positions file 

-参考基因组：这里是 hg38

-输出文件：一个路径

-len：motif 大小设置，默认 8,10,12；越大需要的计算资源越多

-bg：自定义背景序列；

-size: 用于 motif 寻找得片段大小，默认 200bp；越大需要得计算资源越多

-S：结果输出多少 motifs, 默认 25；

-mis：motif 错配碱基数，默认 2bp； 

-norevopp：不进行反义链搜索 motif； 

-nomotif：关闭重投预测 motif；

-rna: 输出 RNA motif，使用 RNA motif 数据库；

-p：设置线程数

-mask: 使用repeated-mask序列

图3 文章结果

图4 homer运行结果

图5 复现结果

运行结果主要看homerResults.html文件即可。由于数据库的更新，结果产生细微变化，但是富集出来的转录因子和之前并无变化，仍然富集到了FOXM1，ERE，TFCP2，表明我们的操作并无错判。

小结

Motif分析在表观转录组中是非常重要的下游分析之一，其运行操作的步骤也相对简单，但是其结果却是对表观转录组的有利解释。