答疑时刻 | 我的SP2/0细胞是否该添加8-氮鸟嘌呤进行复壮了？

产品货号：BDXB-0001  SP2/0 小鼠骨髓瘤细胞

传代后5h

传代后24h

传代后第5天

Q：龙宝，我的细胞在用HAT筛选后有很多单克隆，但是检测后好多都不能分泌抗体，检测出来不是阳性的。这是为什么？

A：有可能是SP2/0细胞出现了返祖现象。

细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，使其对HAT不敏感，所以部分未发生正确融合的SP2/0细胞遗留了下来，形成单克隆，但并不能分泌我们关心的抗体。

Q：那这种情况应该怎么办呢？

A：可以进行SP2/0细胞复壮，定期用8-AG进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。

一、什么是SP2/0细胞8-AG复壮？

8-AG：8-氮鸟嘌呤，英文名8-azaguanine。针状结晶性粉末，约300℃分解；难溶于水，能溶于稀碱和稀酸液。

细胞DNA的合成主要分为两个途径，一个是主要途径，一个是补救途径，而HGPRT酶（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶）是补救途径嘌呤的主要合成酶，正常情况下，细胞可同时通过这两种途径来合成DNA。由于8-氮鸟嘌呤也是一种嘌呤，在含有HGPRT酶时，可作为DNA合成的原料，但8-氮鸟嘌呤是一种碱性细胞杀伤因子，其干扰正常的生物合成途径，从而阻碍细胞发育，最终导致细胞的死亡。而HGPRT酶缺陷的骨髓瘤细胞SP2/0由于不能通过补救途径合成DNA，就可以存活下来。因此原则上经过8-氮鸟嘌呤筛选后的SP2/0细胞都是HGPRT酶缺陷株。

二、在单抗制备中的作用

 在单抗制备的过程中，有一个非常重要的步骤就是细胞融合，即杂交瘤细胞和B细胞的融合。一般情况下，在融合前2周开始复苏骨髓瘤细胞SP2/0，为确保SP2/0细胞对HAT的敏感性，若细胞长期传代或连续培养使用3～6月后，可用8-氮鸟嘌呤筛选一次SP2/0细胞，以防止细胞的突变。

三、该怎样复壮？

使用方法：配置终浓度为10-20ug/ml的8-氮鸟嘌呤，选用10cm细胞培养皿，加入3×106个SP2/0细胞，待细胞贴壁后加入8-氮鸟嘌呤筛选，等待细胞长至95%左右时，重悬后再次分皿，每个皿3×106个细胞，重复上述筛选操作，待细胞长至95%左右时冻存，多冻存几支以备后续用。剩余细胞用完全培养基继续培养1-2周，就可以做接下来的细胞融合了。

注：8-AG难溶于水，可先用DMSO溶解后再用水稀释，DMSO使用终浓度需控制在0.1%，最高不超过

0.5%。