研究背景：

交互抗性

交互抗性（cross resistance）是指昆虫的一个种群由于同一机制，对选择药剂以外的化合物也产生了抗性，也就是常说的正交互抗性。相应的，如果昆虫对另一种化合物变得更敏感，则称之为负交互抗性。

交互抗性通常发生在相同作用机制（mode of action，MoA）的组内，如新烟碱类杀虫剂，拟除虫菊酯类杀虫剂。依赖于不同MoA之间的杀虫剂不会产生交互抗性的假设，目前杀虫剂抗性治理最主要的策略就是不同MoA的杀虫剂轮用（rotation of insecticides）。但事实上，不同MoA产生交互抗性的罕见例子也是有报道的，主要是解毒酶活性增强导致的。但是由于单一的解毒酶（单个基因）导致对不同MoA的杀虫剂产生抗性的机制还未见报道。

CYP6ER1介导的相同MoA杀虫剂之间的交互抗性

之前Zimmer 等人（Curr Biol，2017）的研究表明，CYP6ER1的上调表达是褐飞虱对新烟碱类杀虫剂产生抗性的主导机制。且进一步研究发现CYP6ER1存在8种变体（vA，vB，vC， vD1，vD2，vE，vF，vL），其中vA和vB对吡虫啉的代谢能力最强，vA的关键突变为T318S + A375del + A376G，vB的关键突变为T318S+P377del，其余的变体则对吡虫啉的代谢能力很弱，没有得到进一步关注。抗性个体中通常同时携带有抗性突变和没有抗性突变的旁系同源（paralogs）CYP6ER1，且携带抗性突变的CYP6ER1呈现出不对称高表达（例如vA/vL杂合型，只有vA高表达）。

CYP6ER1除了能够代谢吡虫啉，还能够代谢除了呋虫胺（dinotefuran）以外的其他新烟碱类（neonicotinoids，4A）杀虫剂和丁烯酸内酯类（butenolides，4D）杀虫剂中的氟吡呋喃酮（flupyradifurone）。

CYP6ER1介导的不同MoA杀虫剂之间的交互抗性

氟虫腈Fipronil和乙虫腈Ethiprole都是靶向（拮抗）γ-氨基丁酸门控氯离子通道的苯基咪唑类（phenylpyrazoles，2B）杀虫剂。但由于氟虫腈环境风险较高，已经被禁止用于防治水稻田的稻飞虱，目前中国农药信息网上的数据显示可以用于防治玉米上的灰飞虱。

田间监测结果表明褐飞虱对吡虫啉和乙虫腈都产生了高水平抗药性，暗示两者可能存在交互抗性。此外，有研究表明GABA受体RDL的A301S突变赋予了褐飞虱对乙虫腈的抗性（氟虫腈没有），但相关实验表明这也不能完全解释褐飞虱对乙虫腈和氟虫腈的高水平抗性（Garrood et al.，Pestic Biochem Physiol，2017）。说明还存在其它的抗性机制。通过抑制酶活的相关实验表明，P450和酯酶可能也有相应的贡献。因此作者猜测除了靶标突变，P450基因可能也介导了褐飞虱对乙虫腈的代谢抗性。

基于以上背景，作者想通过研究回答以下三个问题：

（1）CYP6ER1是否能同时赋予褐飞虱对新烟碱类杀虫剂（吡虫啉）和苯基咪唑类杀虫剂（乙虫腈和氟虫腈）的代谢能力？如果能，这些关键突变是什么？

（2）CYP6ER1在SRS4和SRS5中对吡虫啉代谢的关键突变，是否也对苯基咪唑类杀虫剂有效，还是说产生了其他针对苯基咪唑类杀虫剂的突变？

（3）如果CYP6ER1进化出了对不同MoA杀虫剂的代谢能力，那么基因复制duplication和基因分化divergence （即基因新功能化neofunctionalization）在这一过程中发挥的作用是什么？

研究内容：

CYP6ER1vA介导了褐飞虱对乙虫腈的抗性

与敏感品系NLS相比，NLF2和NLF7品系对吡虫啉（283倍和24倍）、乙虫腈（406倍和331倍）和氟虫腈（32倍和3倍）都产生了抗性，继续用乙虫腈筛选，得到大于14,000倍的乙虫腈抗性品系NLF2-eth和NLF7-eth，同时也对氟虫腈产生了860倍的抗性。

NLF2和NLF7品系的CYP6ER1变体分别以vA和vB为主，经过乙虫腈筛选后，qPCR结果表明NLF2-eth的CYP6ER1vA变体显著上调表达，而NLF7-eth的CYP6ER1vB变体没有显著变化（图1）。说明特定的变体CYP6ER1vA可能响应褐飞虱对乙虫腈的抗性，同时对氟虫腈产生了交互抗性。

这里有个令我疑惑的点，NLF7-eth的CYP6ER1vA并没有上调表达，那NLF7-eth对乙虫腈和氟虫腈的抗性增加怎么解释呢，存在其他抗性机制？

为了验证CYP6ER1vA是否也介导了乙虫腈和氟虫腈抗性，构建了表达不同CYP6ER1变体的转基因果蝇品系，并测定其对吡虫啉、乙虫腈和氟虫腈的敏感性。全剂量反应生物测定（full dose-response bioassays，就是测LC50而不是单个浓度的死亡率）结果表明只有CYP6ER1vA能增加果蝇对乙虫腈的抗性（图2A），对氟虫腈则没有影响（图2B）。CYP6ER1vA、vB和vF变体能够增强果蝇对吡虫啉的代谢能力（图2C），与前期的研究结果一致（Zimmer et al.，Curr Biol，2017）。且体外表达的CYP6ER1vA确实能在NADPH存在的情况下将乙虫腈代谢为M+16代谢物（附图2）。这些结果表明特定变体CYP6ER1vA不仅能够赋予宿主对吡虫啉的抗性，也能赋予宿主对乙虫腈的抗性。

CYP6ER1vA介导乙虫腈抗性的关键突变与吡虫啉不同

vA的关键突变为T318S + A375del + A376G，vB的关键突变为T318S+P377del，在底物结合位点SRS4，vA和vB共享T318S 突变，在底物结合位点SRS5，vA则有区别于其他变体的A375del + A376G突变，vB则是P377del突变（图3A）。

构建了含不同关键抗性突变的转CYP6ER1vL（无代谢能力）果蝇，但是这些果蝇并没有对乙虫腈产生抗性（图3B）。同样的，反向构建了不含关键抗性突变的转CYP6ER1vA果蝇，S318T突变和S318T + del375A + G376A突变降低了褐飞虱对乙虫腈的抗性（图3C）。

说明底物结合位点SRS4和SRS5的突变不是对乙虫腈产生代谢能力的主要突变，CYP6ER1vA还存在其他突变增强了褐飞虱对乙虫腈的抗性。

除了SRS4和SRS5，CYP6ER1vA还在其他区域表现出三个氨基酸突变，T176K、S346A和V436I（图4A），且由于都不处于底物结合位点，因此之前并没有被考虑是否影响了对吡虫啉的代谢能力。

在vL中引入T176K突变，果蝇对乙虫腈的抗性显著增加，甚至比vA都高，而令人感到奇怪的是在vA中反向引入K176T突变并没有恢复敏感水平反而增加对乙虫腈的抗性。在vL中分别引入S346A或V436I突变，都能增强果蝇对乙虫腈的抗性，并且反向在vA中引入A346S或I436V突变则恢复了敏感性。

这些结果表明，发生在已知的P450底物结合位点之外的（涉及吡虫啉耐药性）突变导致了对氟虫腈的抗性。这里我其实觉得也能表明多突变是系统性的，就是说突变如果多了，相互之间是存在复杂的拮抗和增效关系，且难以预测。

那这些对乙虫腈有利的突变是否会影响对吡虫啉的抗性呢？按照上一步的套路，研究人员进一步构建了含这些对乙虫腈有代谢能力突变的转CYP6ER1vL果蝇，以及反向逆转这些抗性突变的转CYP6ER1vA果蝇，虽然这些突变导致的LC50都有统计学差异，但是作者认为这种1-2倍的差异还是没有决定性的贡献（图5），这底物结合位点之外的突变并不是对吡虫啉抗性产生的关键性因素。

这要是放在我们“抗药性治理领域”，可是有非常显著的差异了。我看了下转CYP6ER1vL果蝇对吡虫啉的LC50，和他们之前做的差距有点大，之前53.1 mg/L（Curr Biol 2018），现在不知道为啥直奔700 mg/L左右。难道这样说是因为作者不想推翻自己之前的结论？也可能是我个人知识有限，没有深刻理解。

（Curr Biol 2018）

CYP6ER1vA结构与乙虫腈结构变化的相关性

利用AlphaFold2生成了CYP6ER1vA的结构模型（图6），并使用ERRAT和PROCHECK评估了模型的质量（图S3，看不懂所以没放）。

利用CYPED数据库映射突变与结构保守区域： T176K位于循环之间的α-螺旋D和E，S346A位于α-螺旋J的C端残基，而V436位于meander loop和Cys口袋，可以看到这三个位点离底物结合位点很远。

使用CAVER软件来检测和绘制到活性位点的通道，以确定突变是否排列在这些通道中（图6B，显示了两个最突出的隧道）。S346A和V436I残基位于酶的近端，并不位于影响底物通道的位置。同样，在酶的远端的T176K也不能直接影响底物进入的通道。

真核生物的P450通常部分处于膜中，根据Srejber等人的描述预测了CYP6ER1vA浸入膜中的位置，其F/G环和N-端位于膜中。S346A和V436I残基远离膜，而T176K残基则靠近膜表面。

T176K突变导致带正电的侧链取代了极性侧链，这可以与膜脂分子中带负电的头部基团产生静电作用。如果这种吸引作用导致CYP6ER1vA相对于细胞膜的位置和方向产生改变，那么进入活性位点的通路也也能重新定位。例如，埋在脂质双分子层中的通道可以重新定位到离突变酶的更近的表面，使其更容易被亲水化合物获取。

老实说，由于缺乏背景知识，我不是很理解，只能理解这些突变没有直接影响底物进去的通道，但是通过改变蛋白浸没到膜内的位置，改变通道使其更容易与亲水化合物接触，但是氟虫腈是不溶于水的，所以还是不能理解这一块的内容。

为了评价底物的亲脂性（lipophilicity）是否影响与CYP6ER1vA的结合能力，合成了一系列介于氟虫腈和乙虫腈之间的fiproles（等同于苯基吡唑类）化合物，从A到C卤化（halogenation）逐渐减弱，相应的logP值显示疏水性（hydrophobicity）逐渐降低（图7）。氟虫腈logP值最高，更容易进入脂质双分子层，而化合物C由于没有氟元素logP值最低，乙虫腈虽然也没有氟元素但多了一个甲基logP值也较低。

测定了转入不同CYP6ER1的果蝇对这些化合物的敏感性，从氟虫腈到乙虫腈，果蝇的敏感性依次降低。而转CYP6ER1vA果蝇对各类杀虫剂的敏感性显著低于转CYP6ER1vL果蝇和对照果蝇。

以上结果表明乙基和三氟甲基取代强烈影响了CYP6ER1vA代谢苯基吡唑类杀虫剂的能力，因此卤化水平本身并不是影响此类杀虫剂代谢的唯一决定性因素。

总结来说，就是CYP6ER1在底物结合位点的关键突变产生了对吡虫啉的抗性，在底物结合位点以外的关键突变产生了对苯基吡唑类杀虫剂的抗性，这是不同作用机制杀虫剂产生交互抗性产生的分子机制。

作者说有以下四点意义：基因复制的多功能性为适应性进化过程中的新功能的产生提供了机会；两种功能相互存在约束和权衡；底物结合位点以外的氨基酸突变也对P450的底物特异性会产生影响；杀虫剂交互抗性产生的新的分子机制。

但是仍然存在以下疑问：

（1）CYP6ER1主要表达vB的NLF7-eth，其vA并没有上调表达，那它对氟虫腈同样产生了高水平抗性，他的抗性机制是依靠什么，都依赖靶标突变吗？

（2）氟虫腈开始应用的时间晚于吡虫啉，两者的关键突变不同，相互之间是否存在拮抗作用，两者之间又是如何平衡的。田间开始使用氟虫腈后，vA是否继续在继续发生突变。Bass等人将CYP6ER1将变体分为这几类确实有助于我们的理解，但某种程度上也限制了我们的思考，因为当初的vA变体不可能到现在一点都没变（就是这些关键位点突变以外的其他位点），vA本身是不是也在不断地进化。

参考文献

Duarte A, Pym A, Garrood WT, Troczka BJ, Zimmer CT, Davies TGE, Nauen R, O'Reilly AO, Bass C. P450 gene duplication and divergence led to the evolution of dual novel functions and insecticide cross-resistance in the brown planthopper Nilaparvata lugens. PLoS Genet. 2022 Jun 21;18(6):e1010279. doi: 10.1371/journal.pgen.1010279. PMID: 35727851; PMCID: PMC9249207.

Zimmer CT, Garrood WT, Singh KS, Randall E, Lueke B, Gutbrod O, Matthiesen S, Kohler M, Nauen R, Davies TGE, Bass C. Neofunctionalization of Duplicated P450 Genes Drives the Evolution of Insecticide Resistance in the Brown Planthopper. Curr Biol. 2018 Jan 22;28(2):268-274.e5. doi: 10.1016/j.cub.2017.11.060. Epub 2018 Jan 11. PMID: 29337073; PMCID: PMC5788746.

Garrood WT, Zimmer CT, Gutbrod O, Lüke B, Williamson MS, Bass C, Nauen R, Emyr Davies TG. Influence of the RDL A301S mutation in the brown planthopper Nilaparvata lugens on the activity of phenylpyrazole insecticides. Pestic Biochem Physiol. 2017 Oct;142:1-8. doi: 10.1016/j.pestbp.2017.01.007. Epub 2017 Jan 5. PMID: 29107231; PMCID: PMC5672059.