实验技术 | 瞬转与稳转，病毒包装的原理

鲁迅曾说过(说过吗？)：不要做一个只会蒙头做实验的工具人，要会技术，更要懂原理，否则你与初中生又有什么区别？

1.为什么选择HEK293T可以用于转染和病毒包装？

HEK293T是源自HEK293原始细胞系的子代细胞系，转染携带SV40复制起点的质粒载体，产生大量重组蛋白。

293T细胞表达 E1A蛋白，S40 large T抗原，含有S40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。

293T细胞非常容易转染，用磷酸钙、PEI或脂质体转染，效率均可达90%以上(你的转染效率又有多高呢？doge)。

2.瞬转和稳转的区别？

瞬时转染：瞬时转染的方式外源基因并没有转染到细胞的染色体上而是存在于游离的载体上，这样可以在短时间内获得基因的表达产物，但是随着细胞的不断分裂增殖外源基因最终会丢失，无法继续进行重组蛋白的生产；

稳定转染：稳定转染则会将外源基因转染至细胞染色体上，目的基因不会随着细胞传代而消失，稳定转染的细胞株能够长期稳定的生产目的蛋白。

换句话来说，如果只转染目的质粒，而不转染带有整合酶辅助质粒，那么外源基因就无法整合到细胞的基因组上，只能游离啦，这就叫瞬时转染。

3.天才想法——逆转录病毒转染系统

首先，要知道以下知识：

慢病毒载体起源于HIV-1，是HIV的升级版，HIV只能感染CD4+T细胞，改装后让病毒感染亲嗜性增强能够感染几乎所有细胞，非常牛B。HIV还有一个有点就是可以将自己的基因组整合到宿主的基因组中，利用这个功能我们进行稳转细胞株的建立啦。

质粒含有LTR，这玩意可以将LTR之后基因组整合到宿主基因组中转录比较活跃的位点。

病毒包装原理：把基因组替换成我们需要的目的基因，替换掉的部分我们可以通过辅助质粒或者包装细胞提供(辅助质粒)，这样包出来的病毒存在复制缺陷，还能够把目的基因插入到基因组之间，稳定表达。真是一个天才想法呢！

Q1: 为什么我们病毒包装的时候需要辅助质粒？

A1: 因为辅助质粒包含了病毒组装所需要的元件：结构基因和调节基因

病毒基本结构的结构基因gag、env、pol；调节基因tat、rev

Q2:这些元件的功能？

A2:结构基因: gag基因编码基质蛋白、衣壳蛋白和核衣壳蛋白；env基因编码病毒外面的衣壳蛋白gp120和gp41；pol基因编码蛋白酶、整合酶和逆转录酶.

调节基因：tat和rev主要调节病毒的转录和翻译。