北大毛有东团队利用人工智能和冷冻电镜技术，发现重要药物靶点动力学调控机制

2022 年 4 月 27 日，北京大学毛有东教授团队在 Nature 在线发表了题为：USP14-regulated allostery of the human proteasome by time-resolved cryo-EM 的研究论文。

该研究报道了利用自主研发的深度学习高精度四维重建技术，发展并应用时间分辨冷冻电镜，阐明原子水平人源蛋白酶体动力学调控和构象重编程机制的科学发现。

毛有东教授实验室长期致力于发展基于冷冻电镜的动力学重建方法，围绕蛋白酶体、炎症小体等具有重大临床应用前景的靶点系统的结构功能、动力学机制和靶向调控分子设计深入开展前沿交叉研究 ——

2016 年报道了人源蛋白酶体基态的 3.6 Å 冷冻电镜结构及其他三个亚纳米分辨构象，并首次发现一个亚稳态构象的核心颗粒物转运通道处于开放状态（PNAS 2016; 113: 12991-12996）。

2017 年，利用冷冻电镜解析高分辨率蛋白酶体 19S 调控复合体在结合组装伴侣 p28 的自由态的三维结构，阐释了组装伴侣蛋白 Gankyrin/p28 在蛋白酶体组装过程中构象选择的组装机理（Molecular Cell 2017; 67: 322-333）。

2018 年 4 月，报道了 6 个 ATPγS 结合状态下的 26S 蛋白酶体动态结构，包括三个核心颗粒复合物开放态对应的亚稳简并态近原子分辨（4~5 Å）结构（Nature Communications 2018, 9: 1360）。

2018 年 11 月，首次报道了人源蛋白酶体 26S 在降解底物过程中的七种中间态构象的高分辨（2.8~3.6 埃）结构，在原子水平呈现了蛋白酶体和底物相互作用的动态过程，首次实现了对 AAA-ATPase 六聚马达分子内 ATP 水解全周循环的完整过程的原子水平观测（Nature 2019; 565:49-55）。

这一系列工作揭示了蛋白酶体的原子架构、组装原理和降解泛素化底物的动力学基本规律。

图 1. (A) USP14 调控下蛋白酶体复合体降解多泛素化底物的原子结构模型之一。(B) 时间分辨率冷冻电镜解析 13 种中间态的统计分布随蛋白质降解进程的时间演化。（Youdong Mao, CC BY 4.0）

本研究课题进行之初，首先要克服的问题就是 “时间分辨”。蛋白酶体降解底物的过程是很快的，时间尺度在毫秒至秒之间。正常条件下，想要通过冷冻电镜技术捕获此过程的中间态结构，是非常困难的。

所以，课题组首先要让这个过程慢下来。通过大量的条件摸索，重建反应动力学体系和优化反应条件，包括优化缓冲体系、反应温度等条件，课题组优化出较为可行的实验方案，从而使得时间分辨冷冻电镜技术应用成为可能，最终获得了含时的 45,193 张 USP14-26S 复合体降解泛素底物过程中的冷冻电镜透射图样，挑取了 3,556,806 个 USP14-26S - 泛素底物复合体的颗粒图像。

接下来面临的极端挑战就是 “三维分类”，冷冻电镜捕获的复合体图像需要经过一系列的分类，将它们归为不同的构象类别，才能呈现出蛋白反应的动态过程。USP14 结合到 26S 蛋白酶体后，使得降解底物的动力学过程更加复杂，想要在如此多的异构复合体颗粒图像中，鉴别出降解过程的各个时态的高分辨率非平衡构象，传统的三维分类方法是无法实现的。低精度的三维分类将导致低分辩的三维重建，从而无法获取原子水平的动力学信息，无法对含时的数据赋予自洽的动态变化的物理意义。

课题组结合经过数年自主开发的新型深度学习高精度三维分类和四维重建方法，捕获了 USP14-26S 复合体降解多泛素化底物过程的 13 种不同功能中间状态的高分辨率（3.0~3.6 埃）非平衡构象，通过时间分辨冷冻电镜分析，重建了受控蛋白酶体的完整动力学工作周期，并结合分子生物学功能和基因突变研究，阐明了 USP14 和 26S 相互调控活性的原子结构基础和非平衡动力学机制。

研究发现 USP14 的活化同时依赖于泛素识别和蛋白酶体 RPT1 亚基的结合。出人意料的是，USP14 通过别构效应，诱导蛋白酶体同时沿着两条并行状态转变路径发生构象变化；课题组成功捕获到了底物降解中间状态向底物抑制中间状态的瞬时转化。在底物降解途径中，USP14 活化变构地重编程 AAA-ATP 酶马达的构象景观（Conformational landscape）和统计分布，并刺激 20S 底物通道的打开，从而观察到底物持续转运过程的 ATPase 六聚马达非对称 ATP 水解和近乎完整的全周循环周期。

USP14-ATPase 的动态相互作用，使得 ATPase 马达底物识别与 26S 自身的去泛素化酶 RPN11 催化发生去耦合效应，并在 26S 的泛素识别、底物的起始易位和泛素链回收过程中引入三个调控检查点（动力学分岔点）。这些发现为 USP14 调节 26S 的完整功能周期提供了全新的高分辨见解，并为 USP14 靶向药物治疗发现奠定了极为重要的机制基础。

图 2. 通过时间分辨冷冻电镜分析获取的 USP14 调控蛋白酶体底物降解的并行路径模型。（Youdong Mao, CC BY 4.0）