厉害了中国科技！突破性研究：开发高效NADPH系统

酶促反应（氧化/还原）作为当前制药工业的重要组成部分，其中，烟酰胺辅助因子（NADPH和NADH），是氢的常见供体，在生物催化氧化还原过程中起到了关键作用。

NAD(P)H的高效再生遇到挑战

其他辅因子如黄素、PQQ、CoQ等虽然也有应用，但由于成本较高，难以在工业应用中实现化学计量供应。因此，开发经济的辅因子再生系统成为了迫切的需求。

在过去的二十年里，人们致力于开发金属有机化学、电化学、和光化学方法来再生烟酰胺辅助因子，然而，与酶再生相比，很少有方法能够高效地再生NAD(P)H。

在现有的酶工具中，甲酸脱氢酶是一个不错的选择。但也存在一些问题，非金属依赖型的甲酸脱氢酶有时会表现出对NAD+的偏好，而不是NADP+……

解锁新的高效NADPH系统

为了解决这些问题，来自华东理工大学许建和团队从都柏林假丝酵母中选取了一个新的甲酸脱氢酶（CdFDH），通过结合CSR-SALAD和半理性设计方法，来改变这个酶的特性，提高这个酶对NADP+的还原活性，使其能够更好地应用于各种生物催化氧化还原过程。

图1.设计用于NADPH再生的甲酸脱氢酶

在研究酶的特性的过程中，研究人员进行了三轮的突变实验。前两轮的实验后，他们发现，当酶以同型二聚体的形式工作时，在两个单体之间的界面处有一些关键的热点。因此，他们以已经经过两次突变的酶（CdFDH-M2）作为起点，进行了第三轮的突变。在这次实验中，他们在第167位找到了一个有益的突变，这个突变使得酶对NADP+的亲和力略有增加，同时kcat也增加了1.9倍。但是，这个突变使得原本已经恢复的对NAD+的亲和力再次变差。于是，他们又在第16位和第159位引入了另外两个突变，这两个突变最终形成了新的突变体CdFDH-M4。这个新的突变体对NADP+的活性增加到了3.2 U/mg，整体催化活性也有所提高。与原来的酶相比，突变体增加了75倍的活性。

图2.a) CdFDH功能同型二聚体的整体结构。b)提高CdFDHNADP+还原活性的进化策略。c) CdFDH提高NADP+还原活性的进化途径综述。

为了更好地了解突变体的力学改进，研究人员将突变体CdFDH-M4与NADP+共晶，并进行了结构分析。通过与野生型酶的对比，发现突变体M4中的NADP+结合环境发生了深刻变化，这与突变酶中更好的调节有关。同时，突变体M4中的一些关键残基发生了变化，这些变化有助于提高酶的整体催化活性。通过分子动力学模拟，进一步揭示了突变机制和相关运动的重要性。这些研究结果有助于更好地理解酶的结构和功能关系，为酶的优化和改造提供了一定的理论基础。

图3.野生型酶(a)与突变体M4 (b)晶体结构中烟酰胺辅因子结合环境的比较。

为了测试CdFDH-M4的突变体在生物催化过程中的性能，研究人员构建了不同的辅因子再生体系，并与野生型酶进行了对比。他们发现当使用CdFDH-M4这个突变体进行生物催化反应时，反应的转化率达到了90%。而当使用野生型酶时，转化率只有6%。然而，当底物负荷很高时，这个突变体的表现并不理想。与其他工业用酶结合时，系统也表现不好。这意味着，为了更好地应用突变酶，仍需更多的研究和改进。

图4.CdFDH-WT与CdFDH-M4 NADPH再生驱动2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷不对称生物催化还原的比较

总的来说，华东理工大学许建和团队通过结构导向的半理性设计，成功构建了一 个新的FDH突变体(CdFDH-M4)，用于NADPH的高效回收。该CdFDH-M4具有足够的NADP +反应性，可以支持不同类型的nadph所需的生物催化反应。

于此同时，结构分析和分子动力学揭示了突变残基在促进底物/辅因子结合和 FDHs催化循环周转中的关键作用。因此，这项研究为扩展酶促NADPH再生系统提供了一个有价值的例子， 也为如何改善这个FDH超家族的酶促行为提供了一个教训。

参考文献：

[1]Ma W, Geng Q, Chen C, Zheng YC, Yu HL, Xu JH. Engineering a Formate Dehydrogenase for NADPH Regeneration. Chembiochem. 2023 Oct 17;24(20):e202300390.

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