基础知识4：认识MSI/MMR

1. 什么是 MSI/MMR ？

微卫星（microsatellite, MS），又称为短串联重复序列（short tandem repeats，STR），是指细胞基因组中以少数几个核苷酸(多为1~6个)为单位串联重复的DNA序列。

1.1. MSI ：「微卫星不稳定性」

ꔷ 定义：指与正常组织相比，在肿瘤中某一微卫星由于重复单位的插入或缺失而造成的微卫星长度的任何改变，出现新的微卫星等位基因的现象，最常见的是 GT/CA 重复。
ꔷ 分类：MSI分为高度不稳定（MSI-H）、低度不稳定（MSI-L）和稳定（MS-S）
ꔷ 临床意义：
1）MSI与结肠癌、胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肝胆道癌、尿路癌、脑癌和皮肤癌有关，其中与结肠癌的关联最为普遍
2）患有 MSI 的结直肠肿瘤发现于右结肠，与分化差的组织、高粘蛋白原、肿瘤浸润淋巴细胞以及克罗恩病样宿主反应的存在相关。导致结直肠癌的 MSI-H 肿瘤比其他衍生结直肠癌表现出更少的转移（在 II 期癌症中比 III 期癌症更具代表性）。

1.2. MMR ：「错配修复」

ꔷ 定义：是一种识别和修复DNA复制和重组过程中可能出现的错误插入，缺失和错配碱基的系统，也可以修复某些形式的DNA损伤。错配修复的过程需要区分母链和子链，做到只切除子链上错误的核苷酸，而不会切除母链上本来就正常的核苷酸。
ꔷ 组成：MMR系统在参与DNA修复时可涉及到多个错配修复蛋白，包括MutS（MSH2、MSH3和MSH6等）和MutL（MLH1、MLH3、PMS1和 PMS2）两大家族。其中，MLH1、MSH2、MSH6及PMS2是MMR的主导蛋白。
ꔷ 分类：
1）错配修复功能缺陷（Mismatch Repair Deficiency，dMMR）：MMR缺陷，即DNA错配修复功能缺陷，MMR蛋白表达阴性。任一MMR基因功能缺陷均可导致dMMR。
2）错配修复功能完整（Mismatch Repair Proficient，pMMR）：MMR完整，即DNA错配修复功能正常，MMR蛋白表达阳性。

1.3. MSI与MMR的关系

ꔷ MSI多由MMR蛋白表达缺失导致的MMR功能缺陷所致，可以通过检测MMR蛋白缺失来反映MSI状态
ꔷ 一般而言，dMMR相当于MSI-H表型，pMMR相当于MSI-L/MSS表型。
ꔷ MMR与MSI检测不一致情况主要有以下两种类型：
1）dMMR vs MSS，其发生的原因可能为：
① 某些MMR蛋白的缺失，被功能代偿，常见的补偿机制为PMS2和PMS1互补，MSH6和MSH3互补
② MLH1启动子甲基化导致的肿瘤异质性（MLH1蛋白缺失但MSS），从而影响结果判断
③ 新辅助治疗导致的MSH6表达缺失或PMS2表达较弱

2） pMMR vs MSI-H，其发生的原因可能为：
① 某些MMR蛋白发生错义突变，但仍存在相应抗原而被IHC检测所识别为正常表达。但实际上蛋白功能已经丧失，导致错配修复功能的缺陷，已经导致发生MSI。即pMMR假阳性。
② 由四种基因以外的其他基因引起的MSI，如POLE、POLD。

2. MSI/MMR 的检测方法

目前临床上主要采用两种方法检测 MSI/MMR：免疫组织化学法 (immunohistochemistry, IHC) 检测 MMR 异常蛋白，或聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR) 检测 MSI。二代测序 (next generation sequencing，NGS）是近年来出现的新的检测方法。

2.1. 免疫组织化学法（IHC法）

IHC 染色分析 MMR 蛋白表达是最常用的方法，它主要是检测 4 个已知 MMR 蛋白（MLH1、MSH2、MSH6 和 PMS2），阳性表达定位于胞核：
ꔷ 如果 4 个蛋白中 ≥ 1 个不表达，肿瘤可能为 MSI-H；
ꔷ 所有 4 个蛋白表达均阳性为 pMMR（错配修复功能完整）。
优缺点：IHC 便宜易行，但是有可能漏掉一些其他 MMR 蛋白引起的异常，而且由于肿瘤的异质性，整个肿瘤的评分有可能不一致。

2.2. PCR毛细管电泳法

PCR 通常对2个单核苷酸位点（BAT-25和BAT-26）和3个双核苷酸位点（D2S123、D5S346 和 D17S250）位点进行检测，也被称作「2B3D NCI Panel」。
ꔷ MSI 超过 30%（5 个位点中 2 个以上）为 MSI-H；
ꔷ 少于 30%（1 个位点）考虑为微卫星低度不稳定（MSI-L）；
ꔷ 没有不稳定则为微卫星稳定（microsatellite stability, MSS。
优缺点：能够更客观地评估功能性 dMMR 活性，但是对实验室条件要求高，价格相对昂贵。

★ 总的来说，IHC 和 PCR 法检测 MSI/MMR 的敏感性和特异性都很好，dMMR与MSI-H(高度微卫星不稳定)表型相当，pMMR与MSI-L/MSS(低度微卫星不稳定/微卫星稳定)表型相当。IHC-MMR和PCR-MSI检测结果符合率可达90％以上。

2.3 NGS

ꔷ 近年来 ，二代测序平台目标区域测序（NGS panel）、全外显子组测序（WES）、全基因组测序（WGS）开始应用于 MSI 检测。
ꔷ NGS 适用于需要同时检测肿瘤驱动基因和（或）治疗相关基因变异的患者。

比较内容	MMR-IHC	MSI-PCR	MSI-NGS
检测内容	MMR蛋白表达(MLH-1、MSH-2、MSH-6、PMS-2)	单碱基/两碱基微卫星序列长度变化	卫星位点重复序列长度变化，不同Panel微卫星位点数不同
结果判断	4个MMR蛋白任意一表达缺少为dMMR	≥2位点不稳定为MSI-H(检测5-6个位点)	根据不同位点和分析方法制定闯值
优点	· 方法成熟，临床普及度高 · 价格低 · 可直接提示MMR蛋白缺少	· 金标准 · 准确简单快速 · 敏感性高、特异性强 · 易标准化、自动化	· 多应用于中大型panel的伴随检测，综合成本较低 · 结合生信算法优化的数据分析可以更好的提高低突变主度样本的检出。
缺点	· 需要规范的组织前处理 · 组织异质性 · 存在假阴性及假阳性 · 对病理医师要求高，主观因素可能导致结果偏倚	· 价格较贵 · 无法直接判断出功能异常的蛋白	· 技术复杂，不易标准化 · 缺乏行业统一标准和广泛验证，可能因算法不同输出结果不一致 · 价格高 · 无有证试剂
临床应用	为目前我国临床MSI应用/MMR检测的基本推荐	MSI检测公认金标准推荐在具备分子诊断设施的实验室开展	· 单独检测MSI相对时间周期略长 · 市面上探针设计及生信算法水平参差不齐，筛选及验收成本较高